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| Tubulina bIII. |
CAPITULO 6
10.3.
Tubulina bIII
La tubulina bIII es la subunidad de los microtúbulos específica de neuronas,
ampliamente utilizada como marcador neuronal.
La baja señal para tubulina bIII observada en neuroesferas, aumentó
ligeramente en las células resultantes de su plaqueo sobre polilisina (PLL),
tras 18 horas de incubación en medio condicionado por GE-BO. Esa baja expresión del gen se mantuvo a
tiempos más largos (48h) de exposición a medio condicionado por GE-BO. El receptor de estrógeno tipo a, un marcador de aldainoglía,
colocalizó con tubulina bIII en las células
de neuroesfera incubadas en medio condicionado por GE-BO. Esa colocalización del marcador de
aldainoglía con el marcador de neuronas tubulina bIII,
indicó un papel general de precursor neural para esta población glial (Tabla 1, Fig 9).
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| Tabla 1. |
10.4. Antígenos de transplante MHC clases I y II
La expresión de los complejos
mayores de histocompatibilidad, genes clases I y II, (MHC I y II) fué examinada
utilizando análisis de DNA con microarrays e inmunocitoquímica. No se observó
expresión de mRNA específico de los MHC en la aldainoglía derivada de
neuroesferas, ni tras 18 horas, ni tras 48 horas de incubación de las
neuroesferas en medio condicionado por GE-BO (Tabla 2). Aunque en el caso del MHC clase I, los loci Aw2 and S3 son redundantes, no se detectó
en ningún caso un cambio significativo en la expresión génica. El aumento
en la expresión de AF029241, correspondiente al
gen RT1-S3, no fué incluido como un cambio de expresión, porque la
fluorescencia basal casi no fué detectable.
Otros genes MHC examinados, de las
clases Ia o Ib, no fueron afectados por la incubación con medio condicionado
por GE-BO.
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| Tabla 2.
MHC, antígeno mayor de
histocompatibilidad (major histocompatibility antigen). Las células de
neuroesfera en cultivo fueron diferenciadas a células con morfología similar a
la aldainoglía, por exposición a medio condicionado
por glia envolvente del bulbo olfativo (GEBO), por los periodos de tiempo
indicados. El análisis con microarrays
fué utilizado para examinar la expresión de genes respecto a los expresados por
las células de neuroesferas.
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El gen MHC de los mamíferos está dividido en tres regiones,
correspondientes a las clases I, II y
III. La región clase I
codifica moléculas clásicas I (clase Ia)
y no clásicas I (clase Ib). Las proteinas de la clase Ia estan implicadas en la presentación de
antígeno a los linfocitos T, CD8 positivos, mientras que la función
de los genes clase Ib no es conocida.
La región clase II codifica moléculas de la class II, implicadas en la
presentación de antígeno a los linfocitos T, CD4 positivos. Los genes de la clases I y
II estan incluidos entre genes estructurales bien conservados, algunos de ellos
esenciales para las respuestas inmunes adaptativas (procesado de
antígeno y mecanismos de transporte de péptidos). Los dos mRNAs específicos para los MHC clase
II detectados en aldainoglia, no mostraron diferencias de expresión con
respecto a las células control (Tabla 2). La
inmunofluorescencia de los antígenos MHC-I y MHC-II, revelada con los
monoclonales MRC OX-18 (Metzger et al.
2002) and MRC OX-6 (Gessl et al.
1995), respectivamente, fué similar
al fondo (datos no mostrados). Esta baja
expresión de MHC en aldainoglia, observados tanto como mRNA o como proteina, se
correlacionó con una expresión alta del transcripto de tolerancia TORID
(tolerance-related and induced; Tabla 1).
La region clase III contiene
genes implicados en la inmunidad innata, como los componentes del complemento y
las citoquinas (Hurt et al. 2004). Como
fue observado previamente (Hori et al. 2003;
Li et al. 2004), no pudimos
detectar ni el mRNA específico para las clases I y II del MHC (Table 2), ni sus
proteinas correspondientes. Los genes
MHC III no habían sido anotados cuando realizamos nuestros análisis con
microarrays. La baja antigenicidad,
tanto de las neuroesferas como de la aldainoglía derivada de ellas en cultivo
(baja expresión of MHC), junto con la alta expresión de TORID (Tabla 1),
sugieren que las neuroesferas cultivadas y la aldainoglía derivada de ellas,
podrían ser transplantadas en el SNC sin inmunosupresión o con inmunosupresión
ligera.
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Figura
9. Distribución de los genes expresados entre varias categorías funcionales. El análisis por microarrays de los genes
expresados después de 18 y 48 h de cultivo de neuroesferas en medio
conditionado por GEBO; los genes expresados fueron enviados a DAVID (Data Base for Annotation, Visualization and
Integrated Discovery) para encontrar los procesos biológicos afectados por
el tratamiento con el medio condicionado. A la derecha se indica el número de
genes afectados para cada categoría funcional.
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11. Promoción del crecimiento neurítico por
aldainoglia derivada de neuroesferas
Las funciones de los tipos
macrogliales, como tanicitos, pituicitos y GE-BO, incluyen la promoción del
crecimiento de axones y su envoltura rápida y reversible. Estas propiedades, similares a las de las
células de Schawnn, sugieren su agrupamiento en una clase funcional que hemos
llamado aldainoglia (Nieto-Sampedro,
2002). La notable capacidad de la aldainoglía
derivada de neuroesferas para promover el crecimiento de neuritas , se puso de
manifiesto cuando estas células fueron co-cultivadas con neuronas de ganglio
raquídeo (Fig. 10). La aldainoglía promovió el crecimiento y
asociación de las neuritas, para formar fascículos más largos y gruesos que los
observados en los ganglios control (Fig 10).
La fasciculación de las neuritas podría explicarse por la
sobre-expresión de la molécula de adhesión ICAM-1 (Tabla 1). Las células de neuroesfera tratadas con medio
condicionado por GE-BO promovieron con efectividad el crecimiento de neuritas
de las neuronas ganglionares, lo que, junto con la expresión de los marcadores
inmunológicos descritos ( Fig.11), justifican llamar aldainoglia a las células
derivadas de neuroesfera.
Las neuroesferas plaqueadas
sobre un substrato adherente y expuestas a los factores solubles presentes en
el medio condicionado por GE-BO, se diferenciaron a células similares a
aldainoglía (Doncel y col., 2009). La
cuestión es cuales son los factores de crecimiento que regulan esa
diferenciación de las neuroesferas. Por
el momento, el candidato más plausible parece ser un factor de crecimiento de
la familia de la neuregulina, NRG-1, actuando a través de su receptor
específico, una tirosina quinasa (Burden and Yarden
1997; Carraway and Burden 1995).
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Figura
10. (Arriba). Crecimiento neurítico en Ganglios de la raíz dorsal de rata
cultivados sobre (a, b) poli-L-lisina, (c, d) sobre aldainoglía de rata y (e,
f) sobre aldainoglía de ratón. Tinción nuclear con Hoescht
(azul: a, c y e) y con anticuerpo contra neurofilamentos (rojo. b, d y f). Las
gráficas a la derecha muestran la comparación en el crecimiento neurítico de
las neuronas de los ganglios en las tres condiciones. (Abajo). Promoción del
crecimiento neurítico de ganglios de la raíz dorsal de rata, co-cultivados con
aldinoglia derivada de neuroesferas. Los ganglios
de embiones de rata (E15), fueron cultivados en ausencia (fila superior) o
sobre células de aldinoglia (fila inferior). Los cultivos celulares fueron
fijados e inmunoteñidos con anticuerpo policlonal anti-neurofilamento. Barra de
aumento 100 µm.
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11.1. La
aldainoglía derivada de neuroesferas envuelve neuritas, promoviendo su
fasciculación y mielinización
Células
similares a aldinoglía, obtenidas por diferenciación de neurosferas,
incubándolas en una mezcla de medio NB27 y medio condicionado por GE-BO durante
24h , se adhirieron fuertemente al
substrato de cultivo y promovieron
el crecimiento in
vitro
de neuritas de neuronas de ganglio
raquídeo (DRG; Fig. 10 e*, f*, g*, h*). El medio de cultivo de células
derivadas de neurosferas fué eliminado y DRG aislados de embriones de rata de
15 días, fueron co-cultivados con las células similares a aldinoglía. Las
neuronas DRG, plaqueadas en cubres de vidrio junto con células derivadas de
neurosferas durante 5 días, desarrollaron un halo neurítico de diámetro 2.5
veces más grande que DRGs mantenidos en medio control (Fig.10).
El incremento en el crecimiento neuritico de neuronas DRG con respecto a los controles,
causado por la aldinoglía de rata o ratón, fué significativo (P < 0.01). La
velocidad media de crecimiento neuritico aumentó desde 0,4 mm/día en medio control a 1,1
mm/dia en presencia de aldinoglía derivada de neurosferas. Las células
derivadas de neurosferas mostraron propiedades de promoción del crecimiento neuritico similares a las de la GE-BO o a las células de
Schwann. Además, las neuritas de DRGs promovidas por aldainoglía derivada de
neurosferas, aparecieron enpaquetadas en fascículos más gruesos (Fig. 10 f*, g*, h*) que las neuritas formadas en
medio control (Fig. 10 b*, c*, d*) .
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Figura
11. Las células derivadas de neuroesferas presentaron los marcadores
inmunocitoquímicos característicos de la aldainoglía. Las neuroesferas fueron cultivadas sobre substrato tratado con polilisina en medio
conditionado por GEBO, fijadas e inmunoteñidas. La figura muestra fluorescencia
roja para b) inmunotinción para receptor de estrógeno typo a;f) proteina S100; y j)
receptor de neurotrofinas de baja afinidad, p75. Con inmuno fluorescencia verde
inmunotiñen las proteinas de citoesqueleto: c), Nestina, g),Vimentin
and k), GFAP. Los núcleos fueron
contrateñidos con Hoechst (flurescencia azul).
Los paneles d) y h) muestran
co-localización celular de los antígenos.
Las células fueron incubadas en medio condicionado durante 48 horas,
excepto la tinción para GFAP (5 días). Los paneles a, e. i, l, muestran en contraste de fase las células teñidas. Barra de aumento, 100 µm.
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La aldainoglía derivada de neuroesferas
cultivada con DRGs, expresó antígeno
O1 (Fig. 12; Boyd et al., 2005; Doucette
and Devon 1995), como las células de Schwann de los DRG y la aldainoglía in situ o en cultivo primario (Gudiño-Cabrera and Nieto-Sampedro,
2000). La expresión de antígeno O1 por células que envuelven neuritas (Fig.12f
), indica la preparación para mielinizar (Doucette and Devon, 1995; Gudiño-
Cabrera and Nieto-Sampedro 2000; Boyd et al., 2005). La interacción de células
pre-mielinizantes O1-positivas (células de Schwann o aldainoglía derivada de neurosferas) con neuritas de DRG, fué observada
mediante tinción imunocitoquímica doble, con O1 y anticuerpo policlonal de
conejo, anti-neurofilamento (Fig. 12 c, g
). El diámetro de las fibras envueltas
por células O1-positivas, aumentó desde 3-4 μm en DRGs control hasta 14-16 μm
en células cultivadas con aldainoglía derivada de neurosferas (Fig. 12). La superficie de las neuritas de DRG
envueltas por células de Schwann o aldainoglía,
áreas de tinción doble para O1 y neurofilamento, fué visualizada y medida con
ayuda del programa Image J del NIH. Estas
áreas, expresadas como número de pixels comunes, se muestran en una gráfica de
barras en la Fig. 12. La presencia de aldainoglía causó un incremento de 1,5 veces en la superficie de fibras neurofilamento-positivas
envueltas por células mielinizantes, comparada con DRGs control.
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Figura
12. Co-cultivos de ganglio raquídeo con células de aldainoglía derivadas de
neuroesfera. Los ganglios de embriones de rata (E15), fueron cultivados
en ausencia (fila superior) o sobre células de aldinoglia (fila inferior). Los cultivos celulares fueron fijados e
inmunoteñidos con anticuerpo monoclonal anti-antígeno O1 (b, f; fluorescencia
verde) y anticuerpo policlonal anti-neurofilamento (c, g; fluorescencia roja).
El área de colocalización de ambas tinciones (color amarillo),fué identificada
con ayuda del programa de análisis de imagen para Windows, ImageJ y codificada
(d, h, color blanco). En el panel inferior izquierdo están representada las
zonas neuríticas de co-localización y el área neurítica donde se expresa el
antígeno O1 en cultivo control y en el co-cultivo. El área de los cuerpos ganglionares
(*,ganglio raquídeo) no fué incluida en el análisis. Barra de aumento 100 µm.
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